Background: Recombinant human interferon-gamma (rhIFN-γ) is a vital biopharmaceutical protein used in immunotherapeutic treatments. While Escherichia coli is the most common and cost effective expression platform, high-level expression typically leads to the formation of insoluble, inactive inclusion bodies (IBs). Recovering biologically active protein requires efficient solubilization, refolding, and purification strategies to get protein with proper solubility and purity for the bioanalytical methods. Objective: This study aimed to develop a simple approach for the preparation of rhIFN-γ with purity suitable for bioanalytical studies. Materials and Methods: Solubilized rhIFN-γ IBs (in 8 M guanidine hydrochloride) were refolded via a rapid 1:25 dilution method using an L-arginine–assisted refolding buffer (0.1 M Tris-base, pH 9.0). Purification was performed on an automated protein purification system (ÄKTA Purifier), which was operated with a prepacked HiTrap chromatography column containing Sephadex G-75 resin, performing Size Exclusion Chromatography (SEC). Target fractions were analysed by 12% SDS-PAGE alongside reference rhIFN-γ, INGARON®. Results: The refolding process yielded a protein concentration of 840 µg/ml with an efficiency recovery of approximately 54%. Chromatographic separation resolved two major peaks: Peak 1 (P1, 1.17min) and Peak 2 (P2, 2.20min). Electrophoretic characterization demonstrated that P1 contained a sharp, single pure band at approximately 17kDa, migrating identically to the commercial reference drug INGARON®. Peak 2 contained no protein bands, representing buffer additives and low-molecular-weight non-protein impurities. Conclusion: The established simple preparation approach successfully refolded and isolated high-purity monomeric rhIFN-γ. This work provides a reproducible foundation for downstream intact mass spectrometry, structural and functional characterization.

الخلفية:

يُعدّ بروتين الإنترفيرون غاما البشري المُعاد تركيبه () بروتيناً حيوياً صيدلانياً بالغ الأهمية يُستخدم في العلاجات المناعية. وعلى الرغم من أن بكتيريا الإشريكية القولونية (Escherichia coli) تُعدّ منصة التعبير الأكثر شيوعاً وتوفيراً للتكلفة، إلا أن التعبير بمستويات عالية يؤدي عادةً إلى تكوين أجسام احتواء (Inclusion Bodies) غير ذائبة وغير نشطة. ويتطلب استرجاع بروتين ذي نشاط حيوي استراتيجيات فعالة للإذابة، وإعادة الطي (Refolding)، والتنقية للحصول على بروتين يتمتع بالذوبانية والنقاء المناسبين للطرق التحليلية الحيوية.

الهدف:

هاتِفَت هذه الدراسة إلى تطوير نهج بسيط لتحضير إنترفيرون غاما البشري المُعاد تركيبه () بدرجة نقاء ملائمة للدراسات التحليلية الحيوية.

المواد والطرق:

تمت إعادة طي أجسام الاحتواء المُذابة للبروتين ( في 8 مولار من هيدروكلوريد الجوانيدين) باستخدام طريقة التخفيف السريع بنسبة 1:25 عبر استخدام مُعادل لإعادة الطي مُعزز بالـ إل-أرجينين (0.1 مولار ترایس-قاعدة، درجة الحموضة 9.0). وأُجريت التنقية باستخدام نظام أوتوماتيكي لتنقية البروتينات () مُزوّد بعمود كروماتوجرافي مُعبأ مسبقاً يحتوي على راتنج "سيفادكس جي-75" () لتنفيذ تقنية كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (). ثُم حُسّلت المكونات المستهدفة بواسطة رحلان كهربائي بجل بولي أكريلاميد كبريتات ديسيل دوديسيل الصوديوم بنسبة 12% () مقارنةً بالمرجع التجاري لـ ، وهو عقار إنجارون ().

النتائج:

أفرزت عملية إعادة الطي تركيزاً للبروتين بلغ 840 ميكروغرام/مل بكفاءة استرداد تقريبية بلغت 54%. وأسفر الفصل الكروماتوجرافي عن قمتين رئيسيتين: القمة الأولى (، عند 1.17 دقيقة) والقمة الثانية (، عند 2.20 دقيقة). وأثبت التوصيف الكهربائي أن القمة الأولى () احتوت على حزمة نقية مفردة وحادة عند تقريباً 17 كيلو دالتون، لتهاجر بشكل مطابقة تماماً للدواء المرجعي التجاري إنجارون (). بينما لم تحتوت القمة الثانية () على أي حزمة بروتينية، مُمثلةً بذلك إضافات المُنظم (Buffer additives) والشوائب منخفضة الوزن الجزيئي غير البروتينية.

الاستنتاج:

نجح نهج التحضير البسيط المُؤسس في إعادة طي وعزل بروتين إنترفيرون غاما البشري المُعاد تركيبه () أحادي القسيم (Monomeric) فائق النقاء. ويمثل هذا العمل أساساً قابلاً للتكرار لدراسات قياس الطيف الكتلي للكتلة السليمة (Intact mass spectrometry)، والتوصيف الهيكلي والوظائفي اللاحقة.