Publications of TBRI Researchers
الخلفية:يُعدّ بروتين الإنترفيرون غاما البشري المُعاد تركيبه () بروتيناً حيوياً صيدلانياً بالغ الأهمية يُستخدم في العلاجات المناعية. وعلى الرغم من أن بكتيريا الإشريكية القولونية (Escherichia coli) تُعدّ منصة التعبير الأكثر شيوعاً وتوفيراً للتكلفة، إلا أن التعبير بمستويات عالية يؤدي عادةً إلى تكوين أجسام احتواء (Inclusion Bodies) غير ذائبة وغير نشطة. ويتطلب استرجاع بروتين ذي نشاط حيوي استراتيجيات فعالة للإذابة، وإعادة الطي (Refolding)، والتنقية للحصول على بروتين يتمتع بالذوبانية والنقاء المناسبين للطرق التحليلية الحيوية.الهدف:هاتِفَت هذه الدراسة إلى تطوير نهج بسيط لتحضير إنترفيرون غاما البشري المُعاد تركيبه () بدرجة نقاء ملائمة للدراسات التحليلية الحيوية.المواد والطرق:تمت إعادة طي أجسام الاحتواء المُذابة للبروتين ( في 8 مولار من هيدروكلوريد الجوانيدين) باستخدام طريقة التخفيف السريع بنسبة 1:25 عبر استخدام مُعادل لإعادة الطي مُعزز بالـ إل-أرجينين (0.1 مولار ترایس-قاعدة، درجة الحموضة 9.0). وأُجريت التنقية باستخدام نظام أوتوماتيكي لتنقية البروتينات () مُزوّد بعمود كروماتوجرافي مُعبأ مسبقاً يحتوي على راتنج "سيفادكس جي-75" () لتنفيذ تقنية كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (). ثُم حُسّلت المكونات المستهدفة بواسطة رحلان كهربائي بجل بولي أكريلاميد كبريتات ديسيل دوديسيل الصوديوم بنسبة 12% () مقارنةً بالمرجع التجاري لـ ، وهو عقار إنجارون ().النتائج:أفرزت عملية إعادة الطي تركيزاً للبروتين بلغ 840 ميكروغرام/مل بكفاءة استرداد تقريبية بلغت 54%. وأسفر الفصل الكروماتوجرافي عن قمتين رئيسيتين: القمة الأولى (، عند 1.17 دقيقة) والقمة الثانية (، عند 2.20 دقيقة). وأثبت التوصيف الكهربائي أن القمة الأولى () احتوت على حزمة نقية مفردة وحادة عند تقريباً 17 كيلو دالتون، لتهاجر بشكل مطابقة تماماً للدواء المرجعي التجاري إنجارون (). بينما لم تحتوت القمة الثانية () على أي حزمة بروتينية، مُمثلةً بذلك إضافات المُنظم (Buffer additives) والشوائب منخفضة الوزن الجزيئي غير البروتينية.الاستنتاج:نجح نهج التحضير البسيط المُؤسس في إعادة طي وعزل بروتين إنترفيرون غاما البشري المُعاد تركيبه () أحادي القسيم (Monomeric) فائق النقاء. ويمثل هذا العمل أساساً قابلاً للتكرار لدراسات قياس الطيف الكتلي للكتلة السليمة (Intact mass spectrometry)، والتوصيف الهيكلي والوظائفي اللاحقة.
تُعدّ العقارب مفصليات أرجل عريقة وناجحة عاشت على الأرض لملايين السنين. وتتمثل إحدى السمات الرئيسية لنجاحها التطورى في وجود غدد سُّمية متخصصة تفرز السُمّ. يُعدّ سُمّ العقارب مزيجاً معقداً من المركبات النشطة بيولوجياً، ويتأثر تكوينه وحصيلته بعوامل بيئية مختلفة. بحثت هذه الدراسة في تأثير نوع الفريسة على حصيلة السُمّ والبروتين الشخصي (الملف البروتيني) في عقرب ليوروس كوينكويسترياتوس (Leiurus quinquestriatus) المعروف بـ "عقرب الموت" (deathstalker)، وهو نوع ذو أهمية طبية واشتهر بسمّه الذي يحتوي على ببتيدات علاجية مثل الكلوروتوكسين (chlorotoxin). جرى التعرف على العينات جزيئياً باستخدام تسلسل الجينات الريبوسومية الميتوكوندรียة 16S و 12S لتأكيد الهوية النوعية. وأُجريت تجربة تغذية لمدة أربعة أشهر (العدد = 50) لتقييم نظامين غذائيين مختلفين. أثبتت النتائج أن علامات الـ 16S و 12S rDNA الميتوكوندรียة تُعد أدوات موثوقة للتعرف على العقارب. وقد أثر التباين الغذائي بشكل كبير على حصيلة السُمّ؛ إذ أظهرت العقارب التي تغذت على نظام ديدان الوجبة العملاقة (super mealworm) زيادة بنسبة 64% في حصيلة السُم مقارنة بالنظام الغذائي البديل. والجدير بالذكر أنه لم يُلاحظ أي سلوك آكلي لحوم البشر (أكل الحانات/القرناء) بين العينات المدروسة طوال التجربة. علاوة على ذلك، كشف تحليل الرحلان الكهربائي بجل بولي أكريلاميد كبريتات ديسيل دوديسيل الصوديوم () عن أنماط حزم بروتينية واضحة بين المجموعات الغذائية، مما يشير إلى حدوث تغيرات في تركيب بروتين السُمّ مستحثة غذائياً. تسلط هذه النتائج الضوء على التأثير الحاسم للنظام الغذائي على إنتاج سُمّ العقارب. ويُعد فهم هذه العوامل أمراً بالغ الأهمية لتحسين حصيلة السُمّ لأغراض الدراسات البيئية والاكتشافات الحيوية القائمة على السموم.
